作者利用了徐墨课题组之前建立的小鼠肠炎模型5来研究过继性T细胞中基因编辑导致的染色体结构变异在体内命运。在该体系中,仅表达特异识别Helicobacter hepaticus细菌抗原的TCR 的T细胞,首先在体外激活并被Cas9编辑。成功编辑的细胞将被输注至已经定植了Helicobacter hepaticus的免疫缺陷鼠中,进而诱发T细胞依赖的肠炎(图一),该炎性过程与TCR-T或CAR-T细胞介导的肿瘤免疫治疗高度类似。随后,作者利用胡家志课题组前期开发高灵敏测序方法PEM-seq1,6(Nucleic Acids Research | 胡家志课题组开发全面评估基因编辑产物新方法,详细方案已于2022年发表在STAR protocols7),详细追踪并定量分析了Cas9编辑后的T细胞中的染色体结构异常在输注前、输注3周和2个月后的比例及分布特点。
综上,该研究发现基因编辑导致的染色体易位、靶位点的大片段DNA缺失和病毒DNA插入等严重危害基因组稳定性的副产物,在输入至小鼠体内后的2个月内,不仅不会消失,反而在每只接受输注的小鼠(共计16只)中均有部分染色体结构异常发生了剧烈的随机克隆扩增。不仅如此,相比于输注前,该研究在4只(25%)接受输注的小鼠中检测到了更高水平的染色体易位,提示携带有染色体结构异常的T细胞的异常增殖可能会高频发生。因此,该研究不仅为淋巴瘤或白血病中致癌性染色体易位在体内的发展历程提供了启示,而且还提示了采用PEM-seq等方法持续追踪检测基因编辑依赖的过继性细胞疗法(如通用型CAR-或TCR-T,基因编辑后的HSC或胰岛细胞等)或在体基因治疗(黄斑病变等)中基因编辑产物在体内动态变化及命运的必要性。此外,该研究还启示使用更安全基因编辑工具的必要性,如可将染色体结构异常降低至背景水平的Cas9TX等4(Nature Communications | 胡家志研究组开发目前最安全的Cas9基因编辑工具变体Cas9TX)。
北京大学胡家志研究员、课题组刘阳博士和北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院徐墨研究员为该文章的共同通讯作者。胡家志研究员实验室博士研究生吴锦淳,徐墨研究员实验室博士研究生邹梓晔以及胡家志研究员实验室刘阳博士为该文章的共同第一作者,胡家志研究员实验室博士研究生刘栩豪和张丁峥嵘在该工作中亦有重要贡献。该工作得到了中国农业农村部、北大-清华金沙集团1862、科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金、细胞增殖与分化教育部重点实验室、北京大学生命科学学院仪器中心(成像平台及流式平台)、北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院以及北京市科委的大力支持。
1. Liu, M. et al. Global detection of DNA repair outcomes induced by CRISPR–Cas9. Nucleic Acids Research 49, 8732-8742, doi:10.1093/nar/gkab686 (2021).
2. Saha, K. et al. The NIH Somatic Cell Genome Editing program. Nature 592, 195-204, doi:10.1038/s41586-021-03191-1 (2021).
3. Sheridan, C. Off-the-shelf, gene-edited CAR-T cells forge ahead, despite safety scare. Nat Biotechnol 40, 5-8, doi:10.1038/d41587-021-00027-1 (2022).
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5. Xu, M. et al. c-MAF-dependent regulatory T cells mediate immunological tolerance to a gut pathobiont. Nature 554, 373-377, doi:10.1038/nature25500 (2018).
6. Yin, J. et al. Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing. Cell discovery 5, 1-11, doi: 10.1038/s41421-019-0088-8 (2019).
7. Liu, Y. et al. PEM-seq comprehensively quantifies DNA repair outcomes during gene-editing and DSB repair. STAR Protocols 3, 101088, doi:https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.101088 (2022).